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  • 光遗传学:21世纪生命科学领域最引人注目的革新(图)

    光遗传学:21 世纪生命科学中最引人注目的创新之一

    光遗传学虽然是近几年才发展起来的前沿学科,但凭借其独特的高时空分辨率和细胞类型特异性,可以让人们对生命现象的控制达到前所未有的水平,将生物闭环研究带入微观-规模。单细胞水平的干扰时间。

    在国际上,杨毅实验室较早地开展了中心法则的光遗传学研究。2012年,他在Nature Methods中报道了一种简单高效的LightOn光控基因表达系统,实现了哺乳动物体内首次基因表达。,即光遗传学在时间和空间上对RNA转录的精确定量控制[2],这也是中国科学家在这本著名的原创方法论期刊上发表的第一篇原创研究论文。团队发明 LightOn 系统的研究之旅。

    转录后,RNA达到特定的生物学功能后,如何精确控制RNA分子活动的时间和空间?这种技术几乎是空白。

    意识到这一点后,杨毅决定在当时资金不足的情况下启动这项研究。

    他回忆说,这项研究主要包括三个步骤:光控RNA结合蛋白的设计与筛选、光控RNA效应子的设计与构建、光控CRISPR系统的设计与构建。

    其中,第一步是最重要的,也是最具挑战性的。在活细胞中,RNA的代谢主要由细胞内各种类型的RNA结合蛋白进行。

    然而,这些RNA结合蛋白的活性难以调节,一旦合成就具有活性。因此,开发活性可控的RNA结合蛋白有望实现对活细胞内RNA代谢的调控。光遗传学是团队最先想到的控制技术,它让我们能够以前所未有的时间和空间精度精确控制生物体的各种生命活动。

    这样一来,研究目标就很明确了,那就是开发一种光控RNA结合蛋白,并利用光来调控其活性。此前,杨毅课题组在利用合成生物学方法设计和构建光控功能蛋白分子方面积累了丰富的经验。他们利用光诱导蛋白质同源二聚化的创新设计理念激活蛋白质活性,构建了一系列光控DNA结合蛋白。

    这些光控 DNA 结合蛋白由一个光敏蛋白结构域和一个 DNA 识别结合结构域组成。光照会导致它们与 DNA 的结合能力发生变化,从而调节它们与 DNA 的结合。因此,杨毅认为,光控RNA结合蛋白可以根据类似的原理进行设计和构建。

    接下来的难点是如何选择合适的光敏域和RNA结合域,以及如何建立高效的筛选系统。

    Vivid作为光敏结构域来源于粗糙脉孢菌,蓝光照射可以显着改变其结构形成同源二聚体。对其光敏特性的研究已经非常详细。杨毅是第一位开发和利用 Vivid 独特感光特性的科学家。此前,他曾在此基础上设计并构建了多种光控功能蛋白分子。作为光控 RNA 结合蛋白的光敏结构域而生动。

    在RNA结合域方面,为了避免与哺乳动物细胞本身的成分发生交叉反应,该团队利用生物信息学的方法从数据库中筛选出具有已知结构和功能的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。以二聚体形式与特定的 RNA 结合。

    最后,他们专注于细菌的抗转录终止因子。一方面可以满足上述要求,另一方面可以利用细菌的抗转录终止系统来构建高效的筛选系统。通过流式细胞仪,可以高通量筛选具有优异性能的光控 RNA 结合蛋白。

    (来源:自然生物技术)

    在做完之前的基础工作后,杨毅很快得到了一种光诱导特性优异的光控RNA结合蛋白,并将其命名为LicV。

    第二步是光控RNA效应器的设计和构建。LicV本身只是一种光控RNA结合蛋白,光可以引起其与RNA结合能力的变化,从而调节其与RNA的结合。

    该团队设想是否可以将其与 RNA 效应器结合域融合以构建光控 RNA 效应器,从而实现对活细胞中 RNA 代谢的光遗传学精确控制?

    因此,杨毅等人。先后构建了光控mRNA翻译起始因子、光控RNA剪接因子、光控RNA定位因子和光控RNA降解因子。他们发现这些光控 RNA 效应器都具有非常好的光响应特性,能够实现上述精确的时空控制能力。

    (来源:自然生物技术)

    第三步是光控CRISPR系统的设计和构建。该团队将基于 LicV 的 RNA 效应器与 CRISPR 系统相结合的初衷是调节细胞内内源性 RNA 的代谢。但令他们惊讶的是,通过设计嵌合sgRNA,它可以招募更多的效应子,从而使系统表现出明显的扩增效果,比如表现出更高的激活效率。

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    (来源:自然生物技术)

    此外,由于只需要对sgRNA进行简单的修饰,而不需要对Cas蛋白进行基因操作,因此该系统也表现出非常好的通用性,可以在不同物种和不同类型的CRISPR系统上轻松高效地进行。光遗传学调控。

    (来源:自然生物技术)

    杨毅总结道:“我们不仅开发了一种高性能的RNA光控结合蛋白,而且还把它与RNA代谢相关的因子融合,构建了各种光控RNA效应器。万事俱备。”

    期间涉及系统建立、工程优化和试错研究,耗费大量时间。分工方面,由杨毅和陈贤军牵头策划,刘仁美和杨静两位博士完成了具体的实验。

    刘仁美于2011年加入杨毅团队,2013年与陈贤君(当时在读博士)正式开始研究。由于相对新颖的思路和合理的技术路线设计,前期进展相当高效,不到半年就获得了高效的LicV光控RNA结合蛋白。

    他们用LicV在细菌中做了很多测试,结果表明LicV具有优异的性能,但大部分数据并没有体现在论文中。后来,随着团队成员承担的课题越来越多,陈贤军主要聚焦于荧光RNA课题用于活细胞的RNA标记(2019年bd流式细胞仪分析软件,团队发表Nature Biotechnology封面论文,报道Pepper系列高性能荧光RNA,第一次可以在动物细胞中追踪各种类型的RNA[3];2021年,他和他的合作者在Nature Chemical Biology上发表了一篇论文,分析了它的结构[4]。

    (来源:自然生物技术)

    那时的刘仁梅已经把精力投入到其他的话题上,导致接下来的两三年工作都没有全速进行。

    后来,刘仁梅博士毕业时怀孕生子,期间杨静接手该项目,负责部分RNA效应器和LA-CRISPR系统的构建。之后,刘仁梅又回到了这个课题的专职研究,她和杨静终于顺利完成了研究,投稿也很顺利。经过。

    实现治疗性蛋白合成的定时、定位、定量精准控制,有望真正实现精准医疗

    据介绍,该成果是一种独创的方法学,可用于基础生物医学研究,有助于深入分析各种生物物种以及RNA在生物过程中的作用。

    工业技术中还有以下潜在的应用场景:

    1、合成生物学和生物制造。目前国际合成生物学的主要方向是通过人工代谢途径的构建来改变物质的流动方向,进而发展相关的生物制造技术,如生化产品和药物等代谢物。该技术可以通过精准调控RNA代谢来控制基因回路,增强人工代谢途径和宿主细胞的适应性,提高生物制造效率。

    2、精密医学。光遗传学工具在精确控制时间、剂量、速度和可逆性方面具有很强的优势,可以助力精准医疗。

    例如,mRNA疫苗的核心概念就是将mRNA分子传递给人体细胞,使人体细胞通过表达抗原成分使特异性免疫反应失活,从而达到预防免疫的目的。目前,mRNA疫苗不仅可用于疾病预防,未来还可用于疾病治疗。许多制药公司在这方面投入了大量的人力和财力。

    然而,mRNA编码的治疗性蛋白在人体细胞中的表达水平往往对治疗效果影响较大,而目前的技术手段容易出现治疗不足或过度治疗的情况,主要是缺乏可控性。相比之下,杨毅此次研发的基于LicV的LA-CRISPR系统可以实现治疗性蛋白合成的精准定时、定位和定量控制,有望真正实现精准医疗。

    另一方面,上述系统也有望减少传统CRISPR系统的脱靶效应,使其更安全。使用传统的CRISPR系统进行基因治疗时,在基因编辑工作完成后,Cas蛋白仍会长期存在于细胞中,直至被降解。这段时间持续的时间越长,脱靶效应就越明显。相反,LA-CRISPR系统在细胞中的活性可以被精确控制。

    CIRSPR 系统仅在光照条件下有效;如果没有光激活bd流式细胞仪分析软件,即使有光,Cas 蛋白也不会发挥作用。因此,在实际应用中,可以在CRISPR系统完成基因编辑工作后关灯,从而快速灭活CRISPR系统,从而减少脱靶效应,提高基因治疗的安全性。

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