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  • 2.N基因引物探针自身二聚体图(组图)PCR反应

    前两篇文章讨论了CDC试剂盒的组成、结果解读、引物-探针特异性和Tm值。本文讨论引物探针的二聚体和发夹结构。

    1.ORFlab基因引物探针二聚体

    二聚体(自身二聚体或成对二聚体)在设计上通常控制在△G>-4.5kc/m。引物3’端△G值过高,容易在错配位点形成双链结构,引发DNA聚合反应。选择3’端△G绝对值不超过9的引物。

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    图1 ORFlab引物探针自二聚体

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    图2 ORFlab引物-探针配对二聚体

    先忽略△G值问题。看看ORFlab基因上下游引物的自身二聚体,3’端相互配对可以形成稳定的二聚体结构来触发PCR反应,尤其是下游引物。这种引物的PCR效率极低。

    看△G值,两条引物的自身二聚体3’端的△G小于-4.5kc/m,尤其是上游引物△G=-1< @3.4kc/m,肯定会形成稳定的二聚体结构,降低PCR扩增效率。

    ORFlab基因引物探针配对二聚体均可接受上游引物用f表示吗,△G=-<@3.6kc/m,比较理想。

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    2.N基因引物探针二聚体

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    图3 N基因引物探针自二聚体

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    图4 N基因引物-探针配对二聚体

    N基因下游引物自二聚体△G=-6.3kc/m,上游引物△G=-5.1kc/m。上游和下游引物均小于 -4.5kc/m。理论上应该会降低引物扩增效率。

    N基因下游引物和探针对二聚体△G=-10.2kc/m,可形成稳定的二聚体结构上游引物用f表示吗,严重影响反应效率。上游引物与下游引物配对的二聚体△G=-4.7kc/m,与-4.5kc/m相差不大,应该不会影响引物的扩增效率。

    <@3.发夹结构

    如果发夹结构的自由能值大于0 ,结构不稳定,不会干扰反应,如果自由能值小于0 ,结构会干扰反应。

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    图5 ORFlab引物探针发夹结构

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    图6 N基因引物探针发夹结构

    在图5中,ORFlab基因探针的发夹结构△G=-2.2kc/m,这可能会降低探针的利用率,从而降低荧光信号。

    ORFlab和N基因引物发夹结构的△G值接近0,不影响效率。

    4.ORFlab和N基因的相互二聚体结构

    如果我们把ORFlab基因和N基因放在一个管子里,让我们看看它们之间的二聚体结构。

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    图7 ORFlab和N基因二聚体结构

    从图中可以看出ORFlab下游引物和N基因下游引物二聚体△G=-8.3kc/m,会形成稳定的二聚体结构,干扰PCR反应。

    总结:

    CDC宣布新冠核酸检测的引物和探针的二聚体和发夹结构会严重影响引物和探针的效率,降低检测灵敏度。

    在实测中还发现,对于假病毒和质粒样本,CDC公布的引物和探针可以启动线。但是对于很多纯度差、浓度低的临床样本,CDC公布的引物探针基本无法启动。

    三篇文章分析了中国疾控中心公布的用于新型冠状病毒核酸检测的引物和探针序列。引物和探针的评价应该是qPCR的基本技能。我相信疾控中心专家的专业能力。至于为什么会出现这样的结果,大家可以自行评论。

    一家之言,仅供参考。

    接下来,我们来分析一下美国CDC和WHO公布的引物序列!

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